Efter 25 dagars statisk inkubation vid 28°C uppvisade laccas från *Pleurotus ostreatus* NRC620 den högsta aktiviteten i svampodlingsmediet. De optimala pH- och temperaturvärdena för detta enzym var 3,0 respektive 70°C. Efter 2 timmars inkubation vid 40°C och 50°C bibehölls enzymaktiviteten på 68,33 % respektive 59,61 %. Efter 2 timmars inkubation i citrat-fosfatbuffert (pH 7,0) förblev enzymaktiviteten på 100 %. Tillsatsen av 10 mM MgSO₄ och CuSO₄ ökade enzymaktiviteten med cirka 21 % respektive 35 %, medan NaCl, MnCl₂, KCl och CaCl₂ hämmade enzymaktiviteten. Med ABTS som substrat var de kinetiska parametrarna (Km och Vmax) för *Pleurotus ostreatus* NRC 620-laccas 1,99 mM respektive 16 217 μmol min−1 L−1. Enzymatisk behandling av äppeljuiceprover minskade signifikant både pH och viskositet, och denna minskning korrelerade med en ökad lagringstid. Lackasbehandling resulterade i en liten minskning av det totala fenolinnehållet i äppeljuice, men ingen minskning av antioxidantaktiviteten observerades.
Under senare år har forskare fokuserat på tillämpningen av grön bioteknik inom livsmedelsindustrin. Lakkas är ett av de mest användbara enzymerna inom livsmedelsindustrin och finner tillämpningar inom områden som juicebearbetning, bakning, vinstabilisering och förbättring av livsmedelsprodukters organoleptiska egenskaper.1Många högre växter och mikroorganismer utsöndrar laccas,2och svampar som deuteromyceter, ascomyceter och basidiomyceter kan också producera laccas.3Laccas (EC 1.10.3.2) är ett blått oxidas som reducerar molekylärt syre till vatten med hjälp av ett system bestående av tre olika kopparatomer, och därigenom oxiderar olika fenolföreningar och aromatiska aminer. Under produktionen av frukt- och grönsaksjuicer är enzymatisk och icke-enzymatisk brunning kritiska frågor.4Eftersom dessa ämnen negativt påverkar juicens färg, smak och arom måste de tas bort.5
Av alla frukter är äpplen den mest konsumerade världen över och i Europeiska unionen. År 2019 rankades äppelproduktionen som nummer tre globalt, med över 87 miljoner ton.6Äpplen innehåller många fenoliska föreningar, inklusive flavonoider och fenolsyror såsom kaffesyra och klorogensyra.7Eftersom äppeljuice vanligtvis konsumeras i sin klara form förloras cirka 50 % till 90 % av fenolkomponenterna under filtreringsprocessen.8Idag tenderar konsumenter att välja minimalt bearbetade produkter, såsom grumlig äppeljuice med hög polyfenolhalt. Men på grund av sitt höga fenolinnehåll är denna typ av äppeljuice särskilt känslig för missfärgning och mörkfärgning.9Olika tekniker, inklusive värmebehandlingsmetoder som pastörisering vid 60–90 °C, används för att minska eller förhindra att äppeljuice blir mörkare.10Men enligt forskning av Sauceda-Gálvez11, termisk bearbetning kan förstöra flyktiga kemikalier och påverka äppeljuicens organoleptiska egenskaper. Alternativ till termiska bearbetningsmetoder inkluderar superkritisk koldioxid, ultraviolett strålning, ultraljud, högt hydrostatiskt tryck eller högtryckshomogenisering.12Effektiviteten hos dessa tekniker och utbytet av lämpliga fruktjuicer beror på de parametrar som används och produktens egenskaper. Deras utbredda användning begränsas av höga kostnader, negativa effekter på kvaliteten på vissa livsmedelsprodukter eller otillräcklig enzyminaktivering.13,14
Laccase kan användas för att stabilisera och klargöra fruktjuice.15Gökmen m.fl.16rekommenderar användning av laccas för klarning av fruktjuice eftersom det effektivt avlägsnar fenolföreningar genom att omvandla dem till polymerer eller oligomerer som lätt avlägsnas med hjälp av ultrafiltreringsmembran, vilket gör att äppeljuice bibehåller stabil färg och klarhet i upp till sex veckor vid 50 °C. Renat *Trichoderma*-laccas immobiliserades på aluminiumoxidkulor och användes för att selektivt avlägsna bismaksföreningar orsakade av mikrobiell kontaminering av äppeljuice.17
Ungefär 80–90 % av de flyktiga beståndsdelarna i äppeljuice är estrar och aldehyder, vilka ger juicen en unik arom.18Laccas från *Trametes versicolor* immobiliserades på ett billigt stöd gjort av naturlig fiber från unga kokosnötskal för klarning av äppeljuice.19Tidigare studier har undersökt stabiliseringen av äppeljuice (färg och grumlighet) med hjälp av enzymfria eller immobiliseringsmetoder, eller i kombination med ultrafiltrering.5,19Effekten av svamplaccaser på de fysikalisk-kemiska egenskaperna hos äppeljuice under lagring är dock fortfarande oklar. Syftet med denna studie var därför att experimentellt undersöka förändringarna i de fysikalisk-kemiska egenskaperna, innehållet av fenolföreningar och antioxidantaktiviteten hos äppeljuice efter behandling med svamplaccaser och två veckors kylförvaring. Lackaser har förmågan att oxidera fenolföreningar, vilket gör dem lovande för användning i olika industriella processer, inklusive juiceklarning. Denna studie undersökte laccaser från *Pleurotus ostreatus* NRC 620, med fokus på de ideala förhållandena för deras aktivitet och effektivitet vid juiceklarning. Medan forskningen på ostronskivling (P. ostreatus NRC 620) fortfarande är begränsad, har tidigare studier undersökt enzymer från olika svampkällor, såsom Trametes versicolor och Ganoderma lucidum. Syftet med denna studie var att utvärdera den potentiella tillämpningen av detta enzym inom livsmedelsindustrin och belysa dess unika egenskaper, särskilt dess ideala pH och temperatur.
2,2'-Azooxybis(3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra) (ABTS) köptes från Sigma-Aldrich (Kanada). Alla andra reagens var av analytisk kvalitet.
National Research Center's Microbial Culture Collection Center erhöll den kända ostronsvampstammen NRC620. Efter subkultur förvarades denna stam på potatisdextrosagarplattor vid 4 °C. Inokulumberedningsmetoden var följande: 10 dagar gammalt, fullt utvecklat mycelium inokulerades på potatisdextrosagarplattor och inkuberades vid 28 °C. Efter 10 dagar avlägsnades tre mycelblock med 12 mm diameter från agarmediet med hjälp av en steril metallstans och placerades i 250 ml Erlenmeyerkolvar med bomullsproppar innehållande 50 ml steriliserat odlingsmedium (pH 5,0, såsom tidigare beskrivits av Othman et al.20Kulturerna inkuberades vid 28 °C i 18 dagar. Kulturerna filtrerades sedan genom Whatman nr 1 filterpapper, och den resulterande supernatanten fungerade som enzymkälla.
Lackasaktivitet bestämdes med ABTS som substrat. Reaktionsblandningen (2 ml) innehöll 500 μl 0,3 mM ABTS (löst i 0,1 M natriumcitratbuffert, pH 4,5) och den erforderliga mängden enzymprov utspätt med destillerat vatten.21,22Med tanke på att laccas kan oxidera ABTS vid rumstemperatur (28 °C ± 2), bestämdes ABTS-oxidation genom att mäta ökningen i absorbans vid 420 nm (ε420= 36 000 cm²-1 M -1) med användning av en Agilent Carry-100 UV-spektrofotometer. En enhet laccasaktivitet krävdes för att oxidera 1 μmol ABTS per minut. Proteinkoncentrationen bestämdes med Bradford-metoden med bovint serumalbumin som intern kontroll.23,24
Efter att enzymet erhållits från ostronsvampstammen NRC 620 mättes dess aktivitet vid olika odlingsintervall i 25 dagar under statiska förhållanden vid 28 °C.
För att studera temperaturens effekt på laccasaktivitet utfördes experiment i temperaturintervallet 20 till 90 °C. Innan enzymet tillsattes och reaktionen startades blandades bufferten (0,1 M natriumcitrat, pH 4,5) och substratet (ABTS) och inkuberades i 5 minuter vid olika temperaturer. Enzymets termiska stabilitet bedömdes genom inkubation i 0,05 M natriumfosfatbuffert (pH 7,0) vid 40, 50, 60 respektive 70 °C i 2 timmar. Kvarvarande aktivitet bedömdes sedan med hjälp av ABTS-substratet.
Effekten av pH på laccasaktivitet utvärderades med användning av ABTS som substrat i 0,1 M citrat-fosfatbuffertar med ett pH-intervall på 2,5 till 7,0. Enzymlösningen inkuberades vid 40 °C i två timmar i 0,1 M citrat- och Tris-buffertar (pH 3, 4, 6 och 7) för att bedöma pH-stabilitet. Restaktivitet med ABTS som substrat beräknades efter inkubation.
Laccaset inkuberades i 10 minuter i natriumfosfatbuffert (0,05 M, pH 7,0) innehållande olika metalljoner (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ och Mn2+) vid koncentrationer av 2,5 mM respektive 10 mM. Substratet (ABTS) tillsattes sedan för att initiera reaktionen, och den relativa aktiviteten utvärderades.
ABTS-oxidation med lackas vid olika koncentrationer (0,025–3 mM) mättes vid pH 4,5 för att bestämma de kinetiska parametrarna (Vmax och Km). Den kinetiskakonstanterav Michaelis-Menten-ekvationen beräknades med hjälp av ett Lineweaver-Burk-diagram, som ritar invertebralet av reaktionshastigheten som en funktion av substratkoncentrationen. De kinetiska konstanterna beräknades från Lineweaver-Burk-diagrammet med hjälp av GraphPad Prism version 6.01-programvara.
Efter att äpplena noggrant tvättats med kranvatten, delades de i halvor och pressades med en helautomatisk Braun MP80 äppeljuicer (tillverkad i Tyskland). Juicen filtrerades genom fyra lager ostduk. Inga enzymer tillsattes till kontrollgruppen, medan 2,0 % lackas (den mest effektiva koncentrationen som testades) tillsattes till färskgjord äppeljuice, som sedan förvarades vid 4 °C i två veckor.
Titrerbar surhet (TA) och pH bestämdes enligt Boulton et al.-metoden.al.27pH-värdet för varje prov mättes med en digital pH-mätare (JENWAY 3510 pH-mätare). Titrerbar surhet (TA) beräknades baserat på äppelsyra med följande formel.
Där V och C är volymen (ml) respektive koncentrationen (0,1 mol/l) av natriumhydroxidlösningen som används vid titreringen. K är äppelsyraomvandlingskoefficienten, lika med 0,067, och W är massan (g) av äppeljuice.
Totalt antal lösliga fasta ämnen (TDS)-halten i alla juiceprover bestämdes med hjälp av en PAL-1 fickrefraktometer (ATAGO, Tokyo, Japan). Efter varje mätning sköljdes den optiska linsen med avjoniserat vatten och varje äppeljuiceprov testades tre gånger. Värdet för varje prov beräknades genom att medelvärdesberäkna de tre mätningarna. Medelvärdet ± standardavvikelsen för varje äppeljuiceprov beräknades också genom att medelvärdesberäkna dessa resultat.
Viskoelasticiteten hos äppeljuiceproverna bedömdes med hjälp av en rotationsviskosimeter (RV, Rheotest 2, Tyskland). Provet placerades inuti viskometerns "S2"-cylinder. Den skenbara viskositeten representerades av lutningen på skjuvspännings-skjuvhastighetskurvan, vilken beräknades från skjuvspänningen och motsvarande kurvor vid olika skjuvhastigheter (från 1,00 till 437,4 s⁻¹). Formeln för att beräkna den skenbara viskositeten är följande:
Där η är den synbara viskositeten (cP), τ är skjuvspänningen (dyn/cm²), γ är skjuvhastigheten (sek⁻¹), och (τ) beräknas med hjälp av vridmoment- (α) och cylinder- (Z) värdena med följande formel: τ = Z . α.
Brunningsindexet bestämdes enligt Meidavs metod et al.al.29Ett 10 ml juiceprov centrifugerades vid 2750 xg i 10 minuter. 5 ml av juicesupernatanten blandades med 5 ml 95 % etanol. Blandningens absorbans mättes vid 420 nm med hjälp av en Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC).
Totalt fenolinnehåll (TPC) bestämdes kolorimetriskt med hjälp av Folin-Ciocalteu-reagenset enligt beskrivningen av Boulton et al.[27]En standardkurva för gallussyra konstruerades för koncentrationer från 0 till 500 mg/L (r²= 0,997). Resultaten uttrycks som gallussyraekvivalenter (mg GAE/ml).
Tillsätt 125 μL destillerat vatten och 2850 μL FRAP-lösning till 25 μL äppeljuice och låt blandningen stå i mörker i30min. Mät sedan absorbansen vid 593 nm med en Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). FRAP-reagenset framställdes genom att blanda 300 mM acetatbuffert (pH 3,6), 20 mM järn(III)klorid och 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazin (TPTZ) (löst i 40 mM HCl) i förhållandet 10:1:1. En standardkurva genererades med Trolox som standard (R²= 0,999), och resultaten uttrycks som μM Trolox/ml.
Antioxidantaktiviteten hos de behandlade och obehandlade juicerna bestämdes med hjälp av DPPH-metoden för att utvärdera deras förmåga att eliminera DPPH-fria radikaler.31Tio mikroliter juice blandades med 1 ml av en DPPH-lösning (100 μM) i metanol. Efter reaktion i mörker i 30 minuter mättes blandningens absorbans vid 517 nm med hjälp av en Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). Resultaten uttrycktes som troloxekvivalenter (μM trolox/ml) baserat på en kalibreringskurva (R2= 0,990).
De erhållna uppgifterna visade att maximal laccasproduktion observerades i NRC 620 ostronskivling vid slutet av den 18:e fermenteringsdagen, med en aktivitet på 1302 U/L. Detta låg till grund för att bestämma den optimala odlingstiden för laccasproduktion (Figur 1). Även om enzymproduktionen ökade med ökande odlingstid, var ökningstakten inte direkt proportionell mot odlingstiden; efter 21 dagar hade enzymaktiviteten endast ökat med 90 U/L (till 1390 U/L). Därför valdes slutligen 18 dagar som den optimala odlingstiden för att balansera produktutbytet med de ekonomiska fördelarna med ökad odlingstid.
Effekt av odlingstid på laccasutbyte i Pleurotus ostreatus NRC 620. Tre (12 mm) svampmycelblock inokulerades i 50 ml sterilt medium och odlades sedan vid 28 °C under olika tider.
I överensstämmelse med andra studier indikerar våra resultat att den ideala odlingsperioden för att uppnå maximal laccassekretion av svampar sannolikt är mellan 7 och 36 dagar.32Enligt Ezike m.fl.33, *Trametes polyzona* WRF03 producerade den högsta mängden laccas vid slutet av den nionde dagen av fermenteringen, med en specifik aktivitet på 1637 U/mg protein. Dessutom har Othman et al.34fann att *Trichoderma harzianum* S7113 utsöndrade en stor mängd laccas på den femte odlingsdagen. Laccasproduktionshastigheten nådde en toppaktivitet på den fjortonde dagen och minskade sedan gradvis.34Även om enzymsekretion också kan ske under den huvudsakliga tillväxtfasen, når den vanligtvis sin topp under mellanfasen och utlöses av konsumtionen av en kol- eller kvävekälla.34,35
Även om laccas från Pleurotus ostreatus NRC 620 uppvisade hög aktivitet över ett brett temperaturområde från 50 °C till 80 °C, nära maximal aktivitet (69–98 %), observerades dess maximala aktivitet vid 70 °C (Fig. 2a). Utanför detta temperaturområde minskade enzymaktiviteten vid cirka 70 °C. Dessa resultat tyder på att enzymet är aktivt vid höga temperaturer, troligen för att hög temperatur ökar reaktionens kinetiska energi.
Effekt av reaktionstemperatur (a) och pH (b) på lackasaktivitet i *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturer från 20 till 90 °C uppnåddes genom att förinkubera blandningen vid olika temperaturer i 5 minuter innan enzymet tillsattes och reaktionen startades. Effekten av pH på lackasaktivitet utvärderades med användning av ABTS som substrat i lösningar innehållande 0,1 M citrat-fosfatbuffert över ett pH-intervall på 2,5 till 7,0.
Enligt Ezike et al.al.33, den optimala temperaturen för *Trametes polyzona* WRF03 laccase är 55 °C, vilket är samma som för *Ganoderma lucidum*laccase36och liknande den optimala temperaturen (50 °C) för *Trametes polyzona* KU-RNW02737laccas . Baldrian38noterar att, liksom för andra lignin-nedbrytande enzymsystem, är det ideala temperaturintervallet för laccas mellan 50 och 70 °C.
Resultaten visade att enzymet uppvisade den högsta aktiviteten vid pH 3,0 och nådde 94 % aktivitet vid pH 3,5. Det förblev dock aktivt över ett brett pH-intervall från 2,5 till 7,0 (Figur 2b). Dessutom uppvisade det högre aktivitet i sura förhållanden jämfört med neutrala eller alkaliska förhållanden. Dess aktivitet förblev minst 77 % över pH-intervallet från 2,5 till 4,5, men nådde endast cirka 38 % vid pH 7,0. Det optimala pH-värdet för laccas från *Trametes polyzona* WRF03 var 4,533, vilket är detsamma som pH-värdet för laccaser från *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 och *Trametes hirsuta* 41. Enligt studien av Chairin et al.42, det optimala pH-värdet för lackas från *Polymorpha f. sp.* WR710-1 är 2,2, medan det optimala pH-värdet för lackas från *Polymorpha f. sp.* IBL-04 är 5,043. Bindningen av hydroxidanjoner (lackashämmare) till kopparatomerna i T2/T3-lackas kan vara orsaken till den minskade lackasaktiviteten under neutrala eller alkaliska pH-förhållanden. Detta kan störa den interna elektronöverföringen från T1-centret till T2/T3-centret, och därigenombegränsandeenzymaktiviteten23,44
Genom att inkubera enzymet vid olika temperaturer fann man att både inkubationstid och temperatur påverkade enzymets stabilitet. Det är värt att notera att lackas från *Trametes polyzona* NRC 620 uppvisade högre stabilitet vid 40 ℃ och 50 ℃, och bibehöll 68,33 % respektive 59,61 % av sin initiala aktivitet efter 120 minuter (Figur 3a). Däremot, under samma förhållanden (40 ℃ och 50 ℃, 120 minuter), behöll lackas från *Trametes polyzona* WRF03 64,38 % respektive 42,92 % av sin aktivitet.33Tvärtom minskade ökad inkubationstid och temperatur stabiliteten hos *Trametes polyzona* NRC 620-laccas. Efter inkubation vid 60 ℃ och 70 ℃ i 60 minuter minskade dess aktivitet till 39,24 % respektive 1,72 % (Figur 3a). I överensstämmelse med de experimentella resultaten uppvisade laccas från *Trametes polyzona* WRF03 högre stabilitet vid 40 och 50 ℃ under hela den termiska behandlingsprocessen.33På liknande sätt, Lueangjaroenkit et.al.37och ordförande m.fl.al.42rapporterade stabiliteten hos laccaser från Trametes polyzona KURNW027 respektive Trametes polyzona WR710-1 vid 50 °C i 1 timme. Som en användbar biokatalysator som kan tillämpas inom olika biotekniska områden bör laccas ha god stabilitet och prestanda över ett brett temperaturområde.
Termostatisk stabilitet (a) och pH-stabilitet (b) hos laccas från *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatisk stabilitet bedömdes genom att inkubera enzymlösningen i 0,05 M natriumfosfatbuffert (pH 7,0) vid 40, 50, 60 respektive 70 °C i 2 timmar. pH-stabilitet bedömdes genom att inkubera enzymlösningen i 0,1 M citratbuffert och Tris-buffert (pH 3, 4, 6 och 7) vid 40 °C i 2 timmar. Restaktivitet beräknades med ABTS som substrat efter inkubation.
För att fastställa de optimala förhållandena för enzymanvändning och lagring undersökte vi effekten av pH på lackasets stabilitet. Exponering för olika pH-värden påverkade proteinstrukturens stabilitet signifikant, vilket påverkade enzymmolekylens stabilitet och aktivitet. Resultaten visade att enzymet var mindre stabilt under sura förhållanden, medan det uppvisade bättre stabilitet vid högre pH-värden (neutrala och alkaliska regioner). Vid pH-värden på 7,0, 6,0, 4,0 och 3,0 var enzymretentionshastigheterna efter 120 minuter cirka 100 %, 62,54 %, 52,39 % respektive 11,14 % (Fig. 3b). *Strombus multisus* WRF03-lackas uppvisade högre stabilitet vid neutrala pH-värden (5,5–6,5) och lägre stabilitet vid sura pH-värden (under 4,0). Efter 120 minuter vid pH-värden på 5,5, 6,0 och 6,5 var enzymretentionshastigheterna cirka 82 %, 100 % respektive 93 %.33Khairin m.fl.42noterade att laccas från Trametes polyzona WR710-1 var stabil i pH-intervallet 6,0 till 7,0, medan Sayed et al.45visade att lackas var mer stabilt under neutrala pH-förhållanden. Lackas från Cerrena unicolor uppvisade dock även stabilitet under alkaliska förhållanden (pH 9,0).46De studerade laccaserna uppvisade hög stabilitet över ett brett pH-område. Detta kan vara en viktig egenskap för industriella tillämpningar.
Eftersom vissa metalljoner har både stimulerande och hämmande effekter på enzymaktivitet, måste deras effekter på enzymaktivitet beaktas i industriella tillämpningar. Detta är avgörande eftersom metalljoner är vanliga miljöföroreningar som kan påverka stabiliteten och syntesen av extracellulära enzymer.47För att undersöka effekterna av flera metalljoner på laccas från *Pleurotus ostreatus* NRC 620 utförde vi motsvarande experiment. Som visas i figur 4, beroende på vilken typ av metall som användes, påverkade en ökning av metalljonkoncentrationen från 2,5 mM till 10 mM enzymfunktionen negativt. Till exempel,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺ochCu²⁺kunde stimulera och aktivera enzymaktiviteten, medanNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺ochK⁺kunde hämma enzymaktiviteten. Vid en koncentration på 10 mM var Cu²⁺- och Mg²⁺-joner de mest potenta aktivatorerna av lackasaktivitet från *Pleurotus ostreatus* NRC 620, vilket gav en aktiveringsgrad på cirka 34 % respektive 20 %. Vid en koncentration på 10 mM var Ca²⁺-joner dock den mest potenta hämmaren av lackas, vilket minskade enzymaktiviteten med cirka 60 %.
Effekten av metalljoner på aktiviteten hos Pleurotus ostreatus NRC 620-laccas. Laccaset inkuberades i 10 minuter i natriumfosfatbuffert (0,05 M, pH 7,0) innehållande olika metalljoner i koncentrationer av 2,5 mM och 10 mM. Reaktionen initierades sedan genom tillsats av substratet (ABTS), varefter den relativa aktiviteten mättes.
Våra resultat överensstämmer med andra författares resultat som fann att Mg²⁺ och Cu²⁺ ökar aktiviteten hos *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ fann att lackas från *Xylaria* sp. stimuleras i viss utsträckning av kopparjoner (Cu²⁺). Dessutom genomförde Foroutanfar et al.⁴⁹ och Si et al.⁵⁰ liknande studier på lackaser från *Paraconiothyrium variabile* respektive *Trametes pubescens*. Typ II-kopparbindningsstället (T2) för detta enzym kan mättas med Cu²⁺ vid en given koncentration, vilket kan förklara stimuleringen av lackasaktivitet vid högre Cu²⁺³⁹-koncentrationer. Eftersom vitrötasvampars laccaser är oxidaser som innehåller flera kopparatomer, är effekterna av kopparjoner på laccasaktivitet varierande och sträcker sig från stimulerande och hämmande till neutrala.⁵¹ Däremot har Zhou et al.[52]rapporterade attCu²⁺hämmade laccasaktiviteten hos taiwanesiska underjordiska termiter (Odontotermes formosanus). Däremot har laccaser hos Cerena sp. HYB07[53]och Clitocybe maxima[54]påverkades inte av kopparjoner.
Substratspecificiteten representerades av dess kinetiska parametrar (Km och Vmax); ju starkare substratets bindningsaffinitet till enzymet var, desto lägre var Km-värdet och desto högre var substratspecificiteten.3,21,55De kinetiska parametrarna (Km och Vmax) för laccas från *Pleurotus ostreatus* NRC 620 bestämdes med hjälp av GraphPad Prism 6.0-programvaran genom att plotta Lineweaver-Burk-diagrammet (Figur 5). När ABTS användes som substrat var resultaten 1,99 mM och 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,respektive Elsayed et al.21rapporterade att Km-värdena för ABTS-oxidation var 0,1 mM respektive 0,064 mM, vilket indikerar en hög affinitet hos Lac A- och Lac B-isoenzymer för ABTS. Dessutom var Vmax-värdena 0,182 μmol.min⁻¹och 0,603 μmolmin⁻¹, respektive. Det erhållna Km-värdet var lägre än det för Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); dessutom var deras Vmax-värde (1429 mmol min⁻¹) ocksålägrevid användning av ABTS som substrat.33 På liknande sätt var Km-värdena för laccaskoncentrationerna hos Lentinus squarrosulus MR13 och Trametes sp. AH28-2 0,0714 mM respektive 0,025 mM, och Vmax-värdena var 0,0091 mM min−1 och 0,67 mM min−1 mg−1 (i förhållande till ABTS)respektive.56,57
Effekten av ABTS-koncentration på aktiviteten av laccas från *Pleurotus ostreatus* NRC 620 undersöktes, och ett Lineweaver-Burk-diagram över det reciproka värdet av den initiala reaktionshastigheten kontra ABTS-koncentrationen ritades. Oxidationsreaktionen av ABTS med olika koncentrationer (0,025–3,0 mM) laccas mättes vid pH 4,5 för att bestämma de kinetiska parametrarna (Vmax och Km). Michaelis-Mentens kinetiska konstanter beräknades med hjälp av Lineweaver-Burk-diagrammet över det reciproka värdet av reaktionshastigheten kontra substratkoncentrationen. De kinetiska konstanterna beräknades från Lineweaver-Burk-diagrammet med hjälp av GraphPad Prism 6.01-programvaran.
Traditionella klargörande enzymer, såsom pektinaser, hydrolyserar pektinämnen, vilket minskar viskositet och grumlighet. De bryter effektivt ner strukturella polysackarider och används ofta i kombination med andra enzymer, såsom cellulaser och hemicellulaser, för att förbättra utbyte och klarhet. Pektinaser riktar sig dock inte specifikt mot fenolföreningar, vilka är de främsta bidragsgivarna till grumlighet och oxidativ brunning, särskilt i juicer som äppel- och druvjuice.58Däremot katalyserar laccaser oxidationen av fenolföreningar genom att polymerisera dem till större, olösliga molekyler som kan avlägsnas genom sedimentation eller filtrering. Denna mekanism förbättrar inte bara klarheten utan förlänger också juicens hållbarhet genom att minska sannolikheten för oxidativ brunfärgning orsakad av fenolföreningar. Dessutom kan laccasbaserade klarningsprocesser utföras under milda bearbetningsförhållanden (pH 3,5–5,5, temperatur 25–40 °C), vilket gör dem lämpliga för känsliga juicer utan att kompromissa med deras näringsmässiga eller organoleptiska egenskaper.59Studier har visat att pektinasbehandling kan klargöra juice på 1–2 timmar, medan lackasbehandling vanligtvis kräver en längre reaktionstid (3–6 timmar) för att helt reducera fenolföreningar. Denna process kan dock optimeras genom att immobilisera enzymet eller genom att kombinera lackas med mekaniska klarningsmetoder.60I denna studie visade enzymprofilering av det råa extraktet signifikant laccas- och α-amylasaktivitet, medan pektinas- och xylanasaktiviteten var extremt låg, och cellulasaktivitet inte detekterades. Därför berodde minskningen av turbiditet och fenolhalt huvudsakligen på laccasets verkan, medan förändringen i viskositet delvis kan bero på amylasets verkan.
Tabell 1 visar de fysikalisk-kemiska parametrarna för färskpressad äppeljuice och laccasbehandlade prover. Resultaten visade att utbytet av färskpressad äppeljuice (71,59 %) var lägre än för laccasbehandlade prover (87,34 %). Dessa resultat överensstämmer med resultaten från Pilnik och Orange.61, som indikerade att användningen av enzymer i fruktbearbetning kan öka juiceutbytet, förbättra filtreringen och få högkvalitativ, klar juice för koncentrering. Ökningen av juiceutbytet beror främst på ökningen av halten lösliga sockerarter i juicen. Under enzymatisk hydrolys av frukt förstörs mesoglea och pektin i produktens cellväggar och omvandlas till lösliga ämnen såsom neutrala sockerarter och syror.62.pH-värdet för den enzymbehandlade äppeljuicen var signifikant lägre än kontrollgruppens (P < 0,05), och pH-värdet för båda grupperna ökade signifikant under lagring (tabell 1). Dessa resultat överensstämmer med Mark et al.s.63, som noterade att pH-värdet i cashewjuice minskade efter lagring efter värmebehandling. Pektinnedbrytning och galakturonsyrabildning efter enzymbehandling kan vara orsaken till ökningen av pH under lagring. pH-värdet i enzymbehandlade prover låg kvar mellan 4,05 och 4,31 under hela lagringen, medan pH-värdet i obehandlad äppeljuice låg mellan 4,12 och 4,33.
Den totala surhetsgraden (TA) för både obehandlade och laccasbehandlade prover visade en minskande trend med ökande lagringstid (tabell 1). Minskningen av surhetsgraden tillskrevs omvandlingen av organiska syror till kolhydrater eller enzymatiska reaktioner, samt oxidation under lagring av juice.64Den totala surhetsgraden i kontrollproverna av äppeljuice och enzymbehandlade prover var lägre än för andra juicer (jordgubbsjuice 0,9 %, plommonjuice 2,2 %, kumquatjuice 1,0 %, aprikosjuice 2,4 %, apelsinjuice 0,8 %), men liknade den för andra juicer (t.ex. päronjuice 0,3 %).62Dessa skillnader i obehandlad färskpressad äppeljuice kan bero på olika faktorer såsom odlingsförhållanden, genetiska faktorer, mognadsnivå och bearbetningsmetoder.65Minskningen av total surhetsgrad i kontroll- och laccasbehandlad äppeljuice överensstämmer med resultaten som presenterats av Singh et al.66angående minskningen av den totala surhetsgraden i Jin Nuo äppeljuice efter 74 dagars lagring. Å andra sidan, Oshmiansky och Wojdylo67fann inga signifikanta förändringar i äppeljuicens surhetsgrad när man studerade effekten av traditionella klarningsmetoder.
Resultaten som presenteras i tabell 1 indikerar att det totala värdet för lösliga fasta ämnen (TSS) i den laccasbehandlade äppeljuicen var högre än i det obehandlade provet. Dessa resultat överensstämmer med de publicerade studierna.. 68Vidare visar tabell 1 att TSS-värdet för kontrollgruppen med äppeljuice var 9,58 vid den initiala tidpunkten och nådde 11,05 vid slutet av lagringsperioden. Dessa värden är lägre än TSS-värdena för färsk äppeljuice som rapporterats av Hamid et al.. 69(11,2 respektive 11,80). TSS-värdet för de laccasbehandlade äppeljuiceproverna ökade signifikant, med början från 11,23 och upp till 12,93 efter två veckors lagring vid 4 °C (tabell 1). En liknande ökning av TSS under lagring observerades även i citrusfrukter, citroner och söta apelsiner. Ökningen av totalt lösligt fast material (TSS) under lagring kan bero på hydrolys av polysackarider (stärkelse) till monosackarider (sockerarter), ökningen av koncentrationen på grund av uttorkning av juicen och nedbrytningen av pektin i juicen till lösligt fast material. Ökningen av totalt lösligt fast material (TSS) beror sannolikt på ökningen av lösligt socker, vilket kan bildas genom omvandling av pektin eller cellulosa till lösligt socker av pektin respektive cellulas, eller genom hydrolys av stärkelse till sockerarter, som rapporterats av Hamed et al.69.Effekten av lackas på äppeljuicens egenskaper kan observeras visuellt, eftersom lackasbehandlad äppeljuice uppvisar bättre flytförmåga och lägre viskositet än obehandlad juice. Denna observation redovisas i tabell 1; Viskositeten hos det enzymbehandlade provet var 1,87 cP, medan viskositeten hos kontrollprovet var 2,95 cP. Denna signifikanta minskning av viskositeten beror sannolikt på den högre vattenhållande kapaciteten hos pektinliknande substanser och bildandet av en kohesiv nätverksstruktur.
I denna studie undersöktes effekten av laccas på brunningsindex (BI) hos äppeljuice genom att mäta absorbansen vid 420 nm med hjälp av en spektrofotometer. Resultaten visas i tabell 1. Under lagring visade BI hos äppeljuiceprover i både den behandlade och obehandlade gruppen en gradvis ökande trend. BI återspeglar graden av brunning och kan fungera somen viktigindikator på enzymatiska och icke-enzymatiska brunfärgningsreaktioner. Absorbansen ökade signifikant under lagring (P < 0,05). Vid slutet av lagringen varA420Värdet av äppeljuiceprover i kontroll- och enzymbehandlade grupper ökade med cirka 217 % respektive 121 % (tabell 1). Resultaten indikerar att enzymbehandling effektivt kan minska brunfärgningsgraden med cirka 56 %. Resultaten från Bezerra et al.[19]] överensstämmer med våra resultat; De använde laccas-glutaraldehyd-kokosfiber för att klargöra äppeljuice, vilket minskade dess ursprungliga färg med 61 %.
Även om polyfenoler i fruktjuicer har positiva näringsmässiga och terapeutiska effekter på människokroppen, kan de också reagera med proteiner och orsaka grumlighet, sedimentation eller turbiditet i juicen, vilket förändrar produktens smak och arom och förkortar dess hållbarhet.71Syftet med denna studie var att på ett säkert sätt minska halten fenolföreningar i äppeljuice med hjälp av lackas från Pleurotus ostreatus NRC 620. Resultaten som presenteras i tabell 1 visar att den totala halten fenolföreningar i lackasbehandlad äppeljuice minskade signifikant före lagring vid 4 °C. Dessutom minskade även den totala halten fenolföreningar under lagring i båda de studerade proverna (tabell 1). Forskning av Sandri et al.72visade att enzymbehandlad äppeljuice kan behålla sin antioxidantaktivitet och sitt innehåll av fenolföreningar. Resultaten av en studie av Lettera et al.73visar att behandling av apelsinjuice med svamplaccas kan minska innehållet av fenolföreningar i den med upp till 45 %.
Fenolföreningar har visat sig ha egenskaper som att fånga upp fria radikaler, minska och släcka singlettsyrer, överföra väteatomer och donera elektroner till fria radikaler, vilket gör dem till potenta antioxidanter.74Därför användes i denna studie DPPH- och FRAP-baserade metoder för att utvärdera effekten av laccas på antioxidantaktiviteten hos äppeljuice som förvarats i kylskåp i 14 dagar (tabell 2). Båda metoderna visade en ökning av antioxidantaktiviteten under lagring, vilket kan bero på ökningen av fria fenolföreningar eller bildandet av Maillard-reaktionsprodukter (MRP), där Maillard-reaktionsprodukter sannolikt är orsaken till ökningen av antioxidantaktiviteten.75Icke-enzymatiska brunfärgningsreaktioner (inklusive askorbinsyranedbrytning, Maillard-reaktioner och syrakatalyserad nedbrytning av sockerarter) producerar bruna pigment (melanoidiner). Mellanprodukter av askorbinsyranedbrytning och sockernedbrytningsprodukter (såsom karbonylföreningar) kan reagera med aminosyror genom Maillard-reaktioner.76Även om brunfärgning av frukt och grönsaker under lagring har studerats ingående, är vår förståelse av dessa reaktioner fortfarande begränsad.77Jämfört med FRAP-metoden uppvisade laccasbehandlad äppeljuice signifikant lägre antioxidantaktivitet med DPPH-metoden (tabell 2), och antioxidantaktiviteten hos alla prover ökade signifikant med ökande lagringstid. Två olika metoder för att bestämma antioxidantaktivitet användes i denna studie eftersom deras principer skiljer sig åt. DPPH-metoden mäter förmågan att neutralisera fria radikaler, medan FRAP-metoden mäter förmågan att reducera järnjoner. Därför rekommenderas det att använda flera metoder för att bestämma antioxidantaktivitet för att bättre förstå antioxidantaktiviteten hos de studerade proverna.78
Ett av de viktigaste resultaten i denna studie är att *Pleurotus ostreatus*-laccaset NRC 620 uppvisar optimal aktivitet vid 70 °C och pH 3,0. Jämfört med andra svamplaccaser som vanligtvis används för juiceklarning, såsom *Trametes versicolor*- och *Ganoderma lucidum*-laccaser, uppvisar *P. ostreatus* NRC 620 högre termisk stabilitet och ett surare pH. Lackaser från *Trametes versicolor* och *Ganoderma lucidum* uppvisar vanligtvis optimal aktivitet i intervallet 50-60 °C och vid pH-värden mellan 3,5 och 5,0. Denna skillnad kan bidra till förbättrad juiceklarningseffektivitet, särskilt för sura juicer där stabilitet vid lägre pH-värden är avgörande. Den unika egenskapen hos *P. Jämfört med andra studerade svamplaccaser uppvisar *Pleurotus ostreatus* NRC 620 förmågan att fungera effektivt under mer utmanande förhållanden. Dess högre optimala aktivitetstemperatur tyder på potentiella fördelar i industriella tillämpningar, såsom snabbare reaktionshastigheter och minskad mikrobiell kontaminering. Dess låga pH, vilket är väl lämpat för den sura naturen hos många juicer, kan vara användbart i juiceklarningsprocesser. Dessa resultat motiverar ytterligare undersökning för storskalig tillämpning, vilket gör *Pleurotus ostreatus* NRC 620 till ett gångbart alternativ till traditionella svamplackaskällor. Jämfört med tidigare studier fann vi att den optimala temperaturen är 60 °C och det optimala pH-värdet är 3,0. Efter reaktion vid 60 °C i 80 minuter behöll *Ganoderma lucidum*-lackas46% av dess aktivitet.79 Enligt Kurniawati och Nicelle80, *Ganoderma lucidum*-enzymer uppvisar utmärkt till måttlig stabilitet vid 25 °C och pH-värden från 5,0 till 8,0, och stabilitet vid pH 6,0 och temperaturer från 10 till 30 °C. I denna studie fann vi att det optimala pH-värdet och temperaturen för enzymaktivitet för *Pleurotus ostreatus* var 3,0 respektive 70 °C. Efter inkubation vid 40 °C och 50 °C i två timmar behöll enzymet 68,33 % respektive 59,61 % av sin aktivitet. Dessutom uppvisade Pleurotus ostreatus NRC 620-laccas hög aktivitet över ett brett temperaturområde från 50 °C till 80 °C, och nådde nästan maximal aktivitet (69 %–98 %), med maximal aktivitet observerad vid 70 °C.
Sammanfattningsvis uppvisade ostronsvampslaccas NRC620, erhållet under statiska förhållanden, optimal aktivitet och stabilitet över ett intervall av pH- och temperaturförhållanden, vilket uppvisade överlägsen stabilitet jämfört med andra enzymkällor. Tillsatsen av 10 mM MgSO₄ och CuSO₄ ökade enzymaktiviteten med cirka 21 % respektive 35 %. Vid bearbetning till äppeljuice minskade enzymet pH och viskositet, medan fenolhalten endast minskade något under lagring.
Resultaten bekräftar lackas potential inom livsmedelsindustrin, särskilt för klarning av drycker. Genom att specifikt bryta ner fenolföreningar minskar lackas inte bara grumligheten och förbättrar klarheten utan bibehåller även kvaliteten på fruktjuicer under milda driftsförhållanden. Till skillnad från traditionella klarningsmedel som gelatin, bentonit och kiselgel genererar lackas inte avfall eller tar bort behagliga aromer från drycker, vilket gör det till ett mer miljövänligt och hållbart alternativ. Jämfört med andra enzymer och filtreringsmetoder erbjuder lackas dessutom en riktad och kostnadseffektiv lösning utan att kompromissa med produktkvaliteten.
Kyomuhimbo, HD och Brink, HG. Tillämpningar och immobiliseringsstrategier för kopparinnehållande laccaser; en översikt. Heliyon 9, e13156 (2023).
Publiceringstid: 15 december 2025